研究进展：超分辨显微成像技术在活体大脑成像中的应用
超分辨显微成像技术是生物医学领域的重要成像工具，它通过突破光学衍射的极限，以纳米级尺度解析大脑神经元的结构，其在活体大脑成像中的应用对于神经科学的发展具有重要影响。
但由于组织光散射、生物相容性、成像系统兼容性等因素，超分辨显微成像技术在活体大脑成像的深度、速度、时间等方面都受到限制。
基于传统的双光子显微成像策略，上海交通大学生物医学工程学院的高露、高贝贝团队在《中国激光》发表文章，介绍了目前应用于活体大脑成像的受激发射损耗显微成像和结构光照明显微成像的研究进展，分析了它们存在的困难和挑战。
活体大脑成像方法
大脑是一个十分复杂的神经网络，大脑皮层作为大脑的外层结构，是神经元胞体集中分布的区域，在生物的运动控制、感觉体验和记忆等功能中起着关键作用。大脑皮层是神经元胞体集中分布的区域，按神经元特征可分为6层，不同动物的大脑皮层厚度不同。大脑皮层的功能活动与神经元连接、动作电位传递、突触活动及各种蛋白和分子活动相关，对大脑皮层成像有助于研究大脑功能活动，为治疗人类脑部疾病做出贡献。
活体大脑成像方式包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描成像（CT）、核素成像和光学成像等。MRI、CT和核素成像在空间分辨率上存在不足，光学成像具有超高分辨率，可通过荧光探针标记大脑结构实现高时空分辨率成像，但活体大脑光学成像深度受限，一般只能达到1-2mm。
2PLSM的成像原理及其在活体大脑成像中的应用。(a)单光子吸收和双光子吸收的Jablonski图及激发光的空间分布；(b)一种基于增益开关半导体激光器的小鼠大脑内2PLSM成像的原理；(c)小鼠颅窗的安装示意图；(d)刺激小鼠视觉，诱发其大脑皮层活动并进行2PLSM成像；(e)使用波长为1064nm的增益激发光对成年小鼠大脑皮层和海马神经元进行2PLSM成像；(f)使用波长为1280nm的激发光对小鼠大脑皮层血管进行2PLSM成像；
多光子成像技术以其高组织穿透性和光学切片特性被广泛应用于厚组织成像，是目前活体大脑光学成像的主要策略。如双光子激发荧光扫描显微成像（2PLSM），以波长在近红外一区的光为激发光，具有更高的组织穿透性，能够达到将近1mm的成像深度，但2PLSM只能实现单细胞水平的分辨率，难以分辨亚细胞结构。
研究进展
近十几年来发展的超分辨荧光显微成像技术主要分为基于光斑调控（如STED和SIM）和基于单分子定位（如STORM和PALM）两类，还有一些适用于特殊场景的超分辨显微成像技术，如全内反射成像。单分子定位成像技术在活体大脑成像方面应用较少，研究团队主要介绍了STED和SIM这两种超分辨技术在活体大脑成像中的研究进展。
受激发射损耗（STED）
受激发射损耗（STED）使用两束组合激光进行成像，一束激光被聚焦成正常的衍射极限焦斑，使焦斑内的荧光分子处于激发态，另一束波长较长的激光（STED光）使激发态的电子以受激发射损耗的方式回到基态，并发出一个与STED光波长相同的光子。由于STED光是相位调制后中心为零点的甜面包圈形状的光斑，因此STED光的中心没有退激发现象。将激发光与退激发光斑重叠，只允许位于STED零点位置的荧光物质发光，可以提高分辨率。
STED可直接进行光学成像，具有“所见即所得”的特点，能反映更真实的成像结果；基于激光扫描共聚焦成像技术，减小了离焦平面荧光的干扰，具有“光切片”特性；目前已有多种荧光探针可实现STED，从而极大地拓展了其应用范围。
STED成像的原理及其在活体大脑成像中的应用。(a)STED的Jablonski图以及激发光斑、STED光斑和发射光斑示意图；(b)STED技术在小鼠大脑成像中的应用；(c)含相差校正的三维双光子STED(3D-2P-STED)成像技术的原理；(d)对活小鼠大脑进行2P-STED成像的原理以及2P-STED与2PLSM成像效果的比较；(e)对活小鼠大脑皮质层进行可重复超分辨STED成像
德国科学家Hell及其团队成员先后在活的多细胞生物体（秀丽隐杆线虫）和脊椎动物（小鼠）上应用STED成像技术，实现了对神经分泌运动神经元、树突棘活动、树突丝状肌动蛋白细胞骨架形态变化等的超分辨成像，还可实现多标记的STED成像和长期体内树突监测。
例如，他们以至少70nm的横向分辨率记录了成年小鼠躯体感觉皮层的树突棘活动以及视觉皮层的树突丝状肌动蛋白细胞骨架的形态变化，对视觉皮层中PSD95支架蛋白和肌动蛋白丝进行成像，同时对小鼠大脑视觉皮层神经元的突触小泡、树突膜和PSD95支架蛋白进行多标记成像，通过长时程成像实现了长达28d的体内树突监测。
常规STED显微镜采用可见光激发，穿透深度不足，且光漂白和光毒性较强。结合多光子成像技术是一种可能的解决方案，通过长波长激发来降低对生物组织的光毒性。此外，还可以引入时间门控监测的STED成像技术（g-STED），通过延时探测的方式去除短寿命的受激辐射光，以更低的STED光功率实现相同的分辨率；选择荧光寿命长、光稳定性好或饱和强度低的荧光探针，如增强型方酸菁变体染料或稀土掺杂的纳米粒子。
结构光照明显微成像（SIM）
基于莫尔效应，照明图案与样品图案的叠加产生莫尔条纹，而莫尔条纹比原始的叠加图案更容易被观察到，同时又包含叠加图案的信息，因此，根据观察到的莫尔条纹图案和已知的照明图案能够计算出原始的样品图案。通过光栅照明图案，使样品的图像在频域空间发生位移，结合几个不同方向和相位的图像就可以获取两倍于正常大小的频域信息，相当于增加了高频的细节信息。一般通过9帧原始图像就可以重建出一幅超分辨图像，图像分辨率提升至原来的两倍。
SIM操作简单，最大限度地利用了荧光分子，大大降低了照明功率，能实现长期活体成像。
SIM的成像原理及其在活体大脑成像中的应用。(a)SIM的成像原理；(b)自适应光学SIM(AO-SIM)在活体大脑成像中的应用；(c)一种含自适应光学的光片结构照明显微镜(OS-SIM)的简化示意图及其成像效果；(d)模式激活非线性SIM(PANL-SIM)的成像原理以及成像效果
目前，SIM在活体大脑成像方面应用不多，但为活体成像提供了一个较为平衡的方案，具有较广阔的发展前景。
例如，可用于对神经元突触进行高速成像，采用自适应光学对样品进行相差校正，通过具有亚衍射尺寸的荧光珠来评估照明参数，再通过相位上采样和图像配准来减小大脑运动造成的影响，在小鼠和斑马鱼大脑上实现了高速成像；通过2PLSM提高成像深度，结合电光调制器和xy共振扫描组件构建SIM的照明条件，再结合2PLSM技术对小鼠大脑皮质神经元进行高速成像；将SIM与其他成像技术结合，如引入光片显微镜组成光片结构照明显微镜（OS-SIM），再通过自适应光学校正样品和测量过程引入的相差，可以实现高速、高分辨率的体内成像，甚至能够解析神经元突触等亚细胞结构。
SIM已经发展出许多分辨率更高的变体，如饱和SIM（SSIM）、饱和耗尽非线性SIM（SDNL-SIM）以及模式激活 SIM（PANL-SIM），其中的PANL-SIM可以实现约50nm的二维分辨率，甚至可以实现三维亚衍射分辨率成像，但非线性 SIM（NL-SIM）目前还没有应用到体内成像，可能与需要使用特殊的荧光探针有关。
面临挑战
相比于固定样品，活体大脑成像会受到诸多限制，不仅要考虑成像系统与生物的兼容性，还要克服生物组织对光的光散射，最重要的是需要降低激发光、荧光探针等对生物组织的影响。因此，活体动物大脑成像对光照、染料、设备和成像系统等都有更高的要求，特别是在活体水平研究动物时还需要考虑动物的状态。
超分辨成像技术为空间分辨率提供了上升空间，但也同样面临上述问题，甚至还带来了新的挑战。
成像速度
活体动物成像比固定样品成像对成像速度的要求更高，硬件设备（如扫描器件的扫描速度、探测器的探测效率和相机的帧率等）和成像原理是影响成像速度的主要因素。基于单分子定位的超分辨成像技术在成像速度上做出了较大牺牲，而STED这种基于点扫描的成像技术需要牺牲成像视野或图像大小来获取更高的成像速度。
提高成像速度的思路是在不牺牲分辨率的条件下对多个观察点同时采样，一些新型的成像技术实现了大视野或大体积高速成像，如通过将样本成像平面放大到一个更大的球面，结合多个平面传感器，获得了超大视场和高视频频率的成像。
成像深度
目前超分辨成像技术主要是对活体动物的大脑皮层成像，对于一些更深的结构（如海马体）进行成像仍然存在巨大挑战。限制光学显微成像深度的两个主要因素是相差和光散射，相差可通过自适应光学来校正，随着成像深度的增加，相差校正的作用愈加重要。
光散射是困扰厚组织和活体成像的一大难题，随着成像深度的增加，组织对光的吸收和散射作用导致光信号衰减，可通过增加激发光的波长、采用多光子技术或使用具有侵入性的内窥显微镜来提高组织深处的成像效果。
成像时间
限制成像时间的因素主要包括激发光对组织和荧光分子的影响以及成像系统的数据处理能力。长时间的激光辐照会引起荧光分子的光漂白和对生物组织的光毒性，可通过降低激光强度、减少曝光时间、降低曝光频率或采用近红外波段的激发光来减轻激光对组织或荧光分子带来的不良影响，但会降低成像的信噪比，影响成像效果。
超分辨成像比传统光学成像的数据量更大，系统的图像处理性能逐渐成为长时间成像需要考虑的内容，此外，长时间成像还需要关注伤口愈合给成像窗口带来的影响。
荧光探针
荧光探针是决定所有荧光成像技术的最主要因素，对活体动物大脑的成像主要是利用细胞钙离子荧光探针来研究大脑神经元的活动，常见的探针有钙离子敏感染料和基于基因编码的钙离子探针，后者能长期稳定地表达，更适合用于对动物的神经动力学进行长期成像研究。
在进行多通道成像时，需要选择适当的探针以避免串色，在活体成像中，探针的生物相容性和靶向性等也是影响成像的重要因素。开发量子产率更高、稳定性更好的荧光探针能给这一领域带来新的突破。
动物状态
应用于活体动物大脑成像的超分辨技术主要针对已麻醉的动物和固定头部的清醒动物，动物的呼吸和心跳等活动可能会带来运动伪影，可结合图像配准等图像处理方法来减轻影响。
对清醒状态动物大脑活动的研究分为固定动物头部和允许动物自由运动两种形式，目前还没有自由运动小动物大脑的活体超分辨成像相关报道。
总结与展望
传统光学显微镜在活体大脑成像中存在分辨率不足的问题，而超分辨显微成像技术的出现为研究大脑的亚细胞结构和功能提供了新的可能性。STED和SIM是两种主要的超分辨技术，它们在活体大脑成像中取得了一定的成果，但也面临着诸多挑战，如成像速度、成像深度、成像时间、荧光探针和动物状态等方面的限制。
未来，超分辨显微成像技术在活体大脑成像领域具有广阔的发展前景。为了克服当前的挑战，需要进一步改进成像技术和设备，提高成像分辨率、速度和深度，同时降低光毒性和对生物组织的影响。开发新型的荧光探针，提高其量子产率、稳定性和生物相容性，将有助于提高成像效果。此外，结合多种成像技术和算法，实现多模态成像和图像处理，能够提供更丰富的信息。在动物实验方面，需要优化实验设计，减少运动伪影的影响，同时探索对自由运动动物的大脑进行超分辨成像的方法。
相信超分辨显微成像技术的不断发展将为神经科学的研究带来新的突破，有助于我们更深入地理解大脑的结构和功能，为治疗脑部疾病提供更有力的支持。
内容来源：
高露,高贝贝,王富.超分辨显微成像技术在活体大脑成像中的应用[J].中国激光,2022,49(20):2007301.Lu Gao,Beibei Gao,Fu Wang.Applications of Super-Resolution Microscopy Techniques in Living Brain Imaging[J].Chinese Journal of Lasers,2022,49(20):2007301.
